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产品特点： 小包装。采用100ml装，使用更节约、更方便； 简约装，升级产品、组成更简洁、操作更方便； 更稳定，产品系统误差更小，使用更稳定。 适用细胞类型：人源间充质干细胞，组织来源包括骨髓、脂肪、脐带、羊膜、皮肤、牙髓、脐带血、外周血等。 产品适用效果图： 弗元生物推出间充质干细胞鉴定相关产品系列，为间充质干细胞研究提供优质的产品与服务。 文献引用： Zhao ZH, Ma XL, Zhao B, Tian P, Ma JX, Kang JY, Zhang Y, Guo Y, Sun L. Naringin-inlaid silk fibroin/hydroxyapatite scaffold enhances human umbilical cord-derived mesenchymal stem cell-based bone regeneration. Cell Prolif. 2021 Jul;54(7):e13043. doi: 10.1111/cpr.13043. Epub 2021 May 19. PMID: 34008897; PMCID: PMC8249788. Xu Y, Jiang Y, Wang Y, Ren Y, Zhao Z, Wang T, Li T. LINC00473 regulated apoptosis, proliferation and migration but could not reverse cell cycle arrest of human bone marrow mesenchymal stem cells induced by a high-dosage of dexamethasone. Stem Cell Res. 2020 Oct;48:101954. doi: 10.1016/j.scr.2020.101954. Epub 2020 Aug 11. PMID: 32829248. 吕云,王立生.诱导多能干细胞来源的间充质干细胞的生物学特性[J].中国实验血液学杂志,2019,27(04):1253-1258. 张娇;邹翠云;张蓓;江福能;钟惟德;朱建国. 一种可控永生化的逆转录病毒载体和人脐带间充质干细胞及其构建方法[P]. 中国专利:CN201910267989.5,2019-04-03 另外，弗元生物还可提供相应的技术服务，欢迎咨询。 人间充质干细胞成软骨诱导试剂盒 仅用于科学研究 产品信息 产品名称：人间充质干细胞成软骨诱导试剂盒 货号：FY200008 批号：见包装 存储与有效期： 组分A、E于2-8 ℃避光保存，组分B、C、D于-20 ℃避光保存。所有组分均须避免反复冻融及复温，各组分在所需要的温度下有效期为1年，配制完成的预混液于2-8 ℃保存，有效期1个月，完全培养基现配现用，2-8 ℃保存不超过72 小时。 适用细胞： 人骨髓间充质干细胞、人脂肪间充质干细胞、人脐带间充质干细胞、人羊膜间充质干细胞、人牙髓间充质干细胞、人脐带血间充质干细胞，其他组织来源的人间充质干细胞。 产品介绍 间充质干细胞（MSC）具有多向分化的潜能，体外在一定条件下可以诱导分化为脂肪细胞、成骨细胞、成软骨细胞。2006年国际细胞治疗协会（ISCT）确定此三项检测指标是MSC鉴定的必检项目，目前以MSC为基础的研究报道均会对该三个指标进行鉴定。在多种组织来源和制作方法的MSC药品质量控制中，成骨、成脂、成软骨也是必检指标。 为满足科研和制药对MSC分化能力的鉴定，弗元生物结合多年MSC研究经验优化MSC诱导试剂盒，在稳定性、易用性上大幅改进，采用了独创的小包装。该试剂盒的设计用途，首先，用于鉴定人MSC是否具有成骨分化能力，满足MSC质量控制的要求。其次，在再生医学和组织工程研究中，诱导培养基也可作为除支架以外的培养培养体系。另外，诱导培养基还可用于研究诱导分化过程中的其他检测，如mRNA检测、lncRNA检测、microRNA检测、蛋白表达检测、胶原含量检测、免疫组化检测等。 本产品仅适用于科学研究。 操作方法 实验准备 u 试剂配制： 预混液：室温融化添加物B和添加物C，将融化后加入A液，充分混匀，配制成软骨分化培养基预混液。 注意：添加物解冻后旋涡混匀、1000 g短时离心以使溶液集中于管底。将管内溶液加入A液后，吸取A液洗涤溶液瓶两次，将洗涤液加入A液中。预混液必须充分混匀，2-8 ℃保存。 诱导完全培养基：取10 ml预混液置于15 ml离心管中，加入一支添加物D，充分混匀制成诱导完全培养基，此液现配现用。1 ml预混液需加入添加物D的量为10 μl。 注意：诱导完全培养基现配现用，2-8 ℃放置不得超过72小时。整个过程须确保无菌操作，各试剂开封前以75%酒精擦拭表面。 u 自备试剂： l 消化液（0.25%Trypsin-0.04%EDTA或其他 ） l 磷酸盐缓冲液（DPBS） l MSC完全培养基 l 4%中性多聚甲醛溶液 注意：若MSC完全培养基不含血清，则需要准备胰酶抑制剂。MSC消化极易过度，建议稀释0.25%胰酶消化液一倍，且严格控制消化时间。 操作步骤 1. 准备所需诱导分化的MSC，当细胞融合达85%左右时，用消化液消化细胞，细胞沉淀用成软骨诱导预混液重悬。 2. 220 g离心5 分钟，沉淀以预混液重悬，细胞密度约2×106 cells/ml，再次离心，弃上清。 3. 沉淀以成软骨诱导完全培养基重新悬浮，调整细胞密度为2×106 cells/ml。 4. 分别取500 μl细胞悬液接种于15 ml离心管中，220 g离心5 分钟。 注意：每管细胞的总数在5×105至1×106之间，一般以1个T25细胞培养瓶接种一个软骨球为佳，细胞数过少形成的软骨团块较小，细胞数过多则可能会分开成块。正常情况下可形成1-2 mm3的团块。离心以细胞聚团为准，可适当调整。离心力过大，软骨球不易悬浮，离心力过小则可能形成软骨球效果不佳。 5. 旋松离心管盖，将离心管轻轻竖直置于37 ℃、5% CO2培养箱中静置培养。 注意：24 小时内避免摇动细胞沉淀，以确保形成个团块。离心管需使用聚丙烯材质无菌管。 6. 诱导培养24 小时后，轻轻拨动离心管底，使细胞沉淀团块悬浮，重新放回培养箱继续培养。 注意：细胞团块重新悬浮的时间因细胞而定，基本在24-48 小时之间，以细胞团周围有聚拢现象时为准。若细胞团块贴壁较牢固，可用移液器轻轻吹动使其悬浮，注意不要吹散团块。 7. 每2天更换新鲜完全诱导培养基�；灰菏鼻崆嵛ゾ膳嘌�，每管加新鲜配制的成软骨分化完全培养基500 μl。 注意：换液时动作轻柔，以免吸出细胞团块；诱导完全培养基必须经过复温，否则影响诱导效果。在诱导培养2-3周后会出现大量细胞外基质，富含软骨蛋白多糖和Ⅱ型胶原。 8. 诱导培养14-20天，弃去培养上清，DPBS洗细胞两次，4%中性多聚甲醛溶液2 ml/管室温固定细胞1小时。 注意：培养结束时或中途可以选择其他检测方法，如基因表达检测等，若采用自己拟定的检测方法则后续方案需要自己拟定。一般软骨球诱导致密后能进行染色处理，时间在14-20天左右，时间过久可能导致团块内部出现空泡，甚至团块裂开，具体时间请以自己细胞的特性自行确定。 9. 弃去固定液，DPBS洗2次，脱水、石蜡包埋后切片。 注意：脱水包埋可以用擦镜纸包裹后使用自动脱水机脱水、包埋，也可以在原离心管中逐级更换脱水、透蜡的液体，手工包埋。过程中一定注意团块不要丢失。 10. 阿利新蓝染色：将切片进行脱腊和复水，阿利新蓝染液染色30 分钟，流水冲洗5 分钟，脱水、透明、中性树胶封片，显微镜下观察、拍照。 注意：染色和制片过程中避免干片，干片后会导致组织形态发生变化，影响观察、拍照效果。根据需要可以选择苏木素复染，不建议复染。 11. 结果判定：按照程序操作完毕，低倍镜下观察可见蓝色着色，该蓝色染色的为酸性粘多糖，说明实验所用的MSC具有成软骨能力。否则，所使用的MSC无成软骨能力。 注意：该鉴定方法和判定标准为定性实验标准，可根据具体情况设置其他判定方法和标准。以上提供的是包埋切片染色的方案，若实验室条件限制，可选择直接对团块进行染色，方法见B9、B10、B11。若试剂盒用于组织工程软骨诱导，可作为除支架材料以外的诱导液使用。 B9. 弃去固定液，DPBS洗团块2次。 注意：切片染色对实验室条件和病理研究技术有一定的要求，但结果展示较为美观，适合对美观要求较高的使用。为降低试剂盒使用难度、降低时间成本，我们准备了结果判断的备选方案，该方案操作相对简单，对实验室要求较低，耗时较少，也可适当缩短诱导周期。 B9. 阿利新蓝染色：向团块中加500 μl阿利新蓝染液染色30 分钟。弃染色液，加纯水5 ml摇动清洗5分钟/次，反复洗5次。 注意：染色液中的团块不易看清，务必小心吸去上清，避免样本丢失。样本始终需要保持在液体中，避免失水导致形态改变。 注意：染色时间请根据实际情况确定，时间控制在10-30分钟，时间太久颜色过深，可能不易分辨。 注意：使用直接进行诱导球进行染色时诱导周期可以适当缩短，一般情况下15天即可有蓝色着色，时间越久蓝色着色相对越深。具体诱导周期根据实验室的具体情况进行调整。 B10. 结果判定：按照程序操作完毕，低倍镜下观察可见深蓝色着色，肉眼观察也可见蓝色着色，该蓝色染色的为酸性粘多糖，说明实验所用的MSC具有成软骨能力。否则，所使用的MSC无成软骨能力。 注意：结果拍照最好使用反射光拍照设备，用透射光的显微镜会导致结果呈深蓝色或黑色�？梢允褂锰迨骄�、相机或手机相机进行拍摄，结果相对美观。相机或手机相机拍摄时，将清洗过的蓝色小球（诱导球）置于较为宽阔的培养皿，培养皿内装足量的纯水，保持水面平整，且没过小球3-5毫米。皿下置放平整的白纸，避免使用镜面做背景，可使用直尺置于下方进行大小的参照。尽量避免用强光照射，可以用散射光进行打光�？梢栽谛∏虻恼戏脚纳�，也可以稍微倾斜进行拍摄，避免液面反光。
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