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产品特点： 小包装。采用100ml装，使用更节约、更方便； 简约装，升级产品、组成更简洁、操作更方便； 更稳定，产品系统误差更小，使用更稳定。 适用细胞类型：人源间充质干细胞，组织来源包括骨髓、脂肪、脐带、羊膜、皮肤、牙髓、脐带血、外周血等。 产品适用效果图： 弗元生物推出间充质干细胞鉴定相关产品系列，为间充质干细胞研究提供优质的产品与服务。 文献引用： Zhao ZH, Ma XL, Zhao B, Tian P, Ma JX, Kang JY, Zhang Y, Guo Y, Sun L. Naringin-inlaid silk fibroin/hydroxyapatite scaffold enhances human umbilical cord-derived mesenchymal stem cell-based bone regeneration. Cell Prolif. 2021 Jul;54(7):e13043. doi: 10.1111/cpr.13043. Epub 2021 May 19. PMID: 34008897; PMCID: PMC8249788. Xu Y, Jiang Y, Wang Y, Ren Y, Zhao Z, Wang T, Li T. LINC00473 regulated apoptosis, proliferation and migration but could not reverse cell cycle arrest of human bone marrow mesenchymal stem cells induced by a high-dosage of dexamethasone. Stem Cell Res. 2020 Oct;48:101954. doi: 10.1016/j.scr.2020.101954. Epub 2020 Aug 11. PMID: 32829248. 吕云,王立生.诱导多能干细胞来源的间充质干细胞的生物学特性[J].中国实验血液学杂志,2019,27(04):1253-1258. 张娇;邹翠云;张蓓;江福能;钟惟德;朱建国. 一种可控永生化的逆转录病毒载体和人脐带间充质干细胞及其构建方法[P]. 中国专利:CN201910267989.5,2019-04-03 另外，弗元生物还可提供相应的技术服务，欢迎咨询。 人间充质干细胞成脂诱导试剂盒 仅用于科学研究 产品信息 产品名称：人间充质干细胞成脂诱导试剂盒 货号：FY200007 批号：见包装 存储与有效期： 组分A、D、E于2-8 ℃避光保存，组分B、C于-20 ℃避光保存。所有组分均须避免反复冻融及复温，各组分在所需要的温度下有效期为1年，配制完成的完全培养基于2-8 ℃保存，有效期1个月。 适用细胞： 人骨髓间充质干细胞、人脂肪间充质干细胞、人脐带间充质干细胞、人羊膜间充质干细胞、人牙髓间充质干细胞、人脐带血间充质干细胞，其他组织来源的人间充质干细胞。 产品介绍 间充质干细胞（MSC）具有多向分化的潜能，体外在一定条件下可以诱导分化为脂肪细胞、成骨细胞、成软骨细胞。2006年国际细胞治疗协会（ISCT）确定此三项检测指标是MSC鉴定的必检项目，目前以MSC为基础的研究报道均会对该三个指标进行鉴定。在多种组织来源和制作方法的MSC药品质量控制中，成骨、成脂、成软骨也是必检指标。 为满足科研和制药对MSC分化能力的鉴定，弗元生物结合多年MSC研究经验优化MSC诱导试剂盒，在稳定性、易用性上大幅改进，采用了独创的小包装。该试剂盒的设计用途，首先，用于鉴定人MSC是否具有成脂分化能力，满足MSC质量控制的要求。其次，诱导培养基还可用于研究诱导分化过程中的其他检测，如mRNA检测、lncRNA检测、microRNA检测、蛋白表达检测、油脂定量检测、免疫组化检测等。再者，该产品诱导MSC分化为的脂肪细胞多为多泡脂肪细胞样，当脂肪滴融合过大时容易脱壁，难见单泡脂肪细胞样。用于脂肪研究可斟酌使用本产品。 本产品仅适用于科学研究。 操作方法 实验准备 u 试剂配制： 诱导液B：2-8℃过夜融化添加物B液，B液使用前须37℃复温30分钟，充分混匀。将基础培养基A液平均分成2份，各45 ml，加入添加物B液配制成完全诱导培养基B，充分混匀。 诱导液C：2-8℃过夜融化添加物C液，加入基础培养基A液的另一份45 ml，配制成完全诱导培养基C，充分混匀。 注意：添加物B液必须充分复温，内容物充分解冻为透明无沉淀�；旌铣捎盏纪耆嘌蟊匦氤浞只煸�，2-8 ℃保存。整个过程须确保无菌操作，各试剂开封前以75%酒精擦拭表面。 油红O染液（工作液）：取油红O储液，与蒸馏水以3：2的比例混合均匀，中性滤纸过滤，即配制成了油红O染液（工作液）。 u 培养皿处理： 加适量包被溶液D液到培养器皿中，轻轻摇动使其覆盖整个培养器皿底面，室温静置30-60分钟。弃去溶液，室温晾干。 注意：包被液C使用前必须进行室温复温。建议使用六孔板，每孔加D液1 ml，使用其他培养器皿时需考虑实验结果的稳定性。整个过程需在超净工作台中操作，避免污染。 u 自备试剂： l 消化液（0.25%Trypsin-0.04%EDTA或其他 ） l 磷酸盐缓冲液（DPBS） l MSC完全培养基 l 4%中性多聚甲醛溶液 注意：若MSC完全培养基不含血清，则需要准备胰酶抑制剂。MSC消化极易过度，建议稀释0.25%胰酶消化液一倍，且严格控制消化时间。 操作步骤 1. 准备所需诱导分化的MSC，当细胞融合达85%左右时，用消化液消化细胞，并用MSC完全培养基重悬。 2. 按照3×104 cells/cm2的密度将细胞接种于已包被处理的六孔板中，每孔MSC完全培养基2 ml，37℃、5%CO2培养箱中培养。 注意：细胞密度为该试剂盒的标准密度，可根据实验室情况进行调整，调整依据参照所检测MSC正常传代的密度的2倍接种，培养24小时后添加诱导培养完全培养基；或接种密度低，待细胞生长至下一步要求的密度后进行诱导。 3. 当细胞融合达90%时，弃去培养上清，每孔添加诱导液B 2 ml/孔，37℃、5%CO2培养。 注意：成脂诱导后细胞易脱壁，换液时完全培养基必须经室温复温30分钟。添加培养基时动作要轻柔，沿培养器皿侧壁缓缓加入，避免吹起细胞。细胞起始诱导融合度对诱导效果十分关键，必须确保细胞生长至足够密时再进行诱导。 4. 诱导培养72 小时后弃去原培养上清，添加诱导液C 2 ml/孔，37℃、5%CO2继续培养。 5. 继续诱导培养24 小时后弃去原培养基，添加诱导液B 2 ml/孔，37℃、5%CO2继续培养。 6. 重复步骤4、5约3-5次，待细胞内出现明显脂滴时更换为诱导液C继续培养。 7. 注意：一般在培养4天左右高倍镜下能看到细胞浆内有较多数量的圆形亮泡，5-9天融合为较大的亮泡，这些结构围绕在细胞核周围，较大的与细胞核大小相当。状态较好的细胞10天内可结束培养过程，若10天后仍未见脂滴结构，请注意分析操作步骤与其他原因。 8. 每2天更换新鲜诱导液C，继续培养至脂滴足够大时培养结束。 注意：换液时诱导液必须经过复温，否则影响诱导效果和可能导致细胞脱壁。根据实验需要选择培养结束时间，若成脂面积过大或脂滴过大导致连成片则不利于结果的呈现，建议提前终止。不同实验室MSC诱导时出现脂滴的时间不尽相同，若大面积出现脂滴较早，则可提前更换为诱导液C。 9. 诱导培养结束时，弃去培养上清，DPBS洗细胞两次，4%中性多聚甲醛溶液2 ml/孔室温固定细胞20分钟。 注意：培养结束时或中途可以选择其他检测方法，如基因表达检测等，若采用自己的检测方法则后续方案需要自己拟定。 10. 弃去固定液，DPBS洗2次，加入油红O染液（工作液）1 ml/孔染色15分钟。 注意：该步骤适用于鉴定成脂能力，若出现脂滴（脂肪细胞）则会呈现红色着色。若需要得到美观的图片，则染色时间需自己掌握。 11. 弃去油红O染液（工作液），DPBS洗3次。 注意：染色后肉眼可见孔内明显染红。染色过程中一定要避免组织细胞被风干，风干会影响显微观察效果。 12. 显微镜下观察并拍照。 注意：拍照一般选用高倍镜，请根据需要确认选择。 13. 结果判定：按照程序操作完毕，低倍镜下观察可见大面积红色着色点，20倍和40倍镜下可观察到红色球形在细胞内的情况，此红色着色球为脂滴，说明实验所用的MSC具有成脂能力。否则，所使用的MSC无成脂能力。 注意：该判定标准仅进行定性分析，若需要进行定量分析，需要自行制定方案。
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